On fetomaternal hemorrhage
Transplacentaire passage van foetale cellen naar de maternale circulatie tijdens de zwangerschap of de bevalling komt bij vrijwel alle zwangeren in meer of mindere mate voor. Hoewel de foetale en de maternale circulatie van elkaar gescheiden zijn door de zogenaamde placentaire barrière, kunnen foetale cellen, als gevolg van microscopisch kleine onderbrekingen in deze barrière, terechtkomen in de maternale circulatie. Deze cellen zijn voornamelijk afkomstig van het foetale hematopoietische systeem en van de trofoblastcellaag. Tevens kunnen plasma-eiwitten en DNA van foetale origine worden aangetoond in maternaal bloed. Wanneer sprake is van een kleine hoeveelheid cellen wordt gesproken van foetomaternaal celverkeer. In geval van een groter volume wordt meestal de term foetomaternale transfusie gebruikt.
In 1893 beschreef Schmorl voor het eerst trofoblastcellen in longcapillairen van vrouwen die waren overleden ten gevolge van eclampsie. Hierna hebben vele onderzoeksgroepen foetale cellen aangetoond in maternaal bloed en andere organen, zoals beenmerg, lever en huid.
Het is bekend dat foetomaternaal celverkeer complicaties kan veroorzaken in de vorm van foetale anemie of alloimmunisatie. Het bepalen van het exacte volume foetaal bloed dat naar de moeder is getransfundeerd, is met name van belang voor het toedienen van de juiste hoeveelheid anti-D immunoglobuline aan rhesus D negatieve vrouwen die zwanger zijn van een rhesus D positieve foetus.
In dit proefschrift worden microscopische en flowcytometrische methoden beschreven om foetale erythrocyten en lymfocyten in maternaal bloed aan te tonen. Om de verschillende methoden met elkaar te kunnen vergelijken, zijn artificiële verdunningen alsook bloedsamples van zwangere vrouwen na een invasieve procedure of een zwangerschapscomplicatie geanalyseerd. Automatische microscopische analyse van bloeduitstrijken, gekleurd volgens de Kleihauer-Betke methode als nieuwe techniek voor detectie van foetale erythrocyten in maternaal bloed, is ontwikkeld. Vervolgens zijn de verdwijningscurves van foetale erythrocyten en lymfocyten bestudeerd. Voor het aantonen van foetale lymfocyten is een humaan monoclonaal antilichaam gericht tegen het human leukocyte antigen (HLA) gebruikt. Voorts werd het belang van het toepassen van de juiste formule voor het berekenen van het foetomaternale transfusievolume uiteengezet. De resultaten van de afzonderlijke studies die verband houden met foetomaternale transfusie, worden beschreven in deze samenvatting.
Het is bekend dat bij meer dan de helft van de zwangeren al tijdens de zwangerschap foetale cellen aantoonbaar zijn in de circulatie. Postpartum worden bij vrijwel alle zwangeren foetale cellen in het bloed gevonden. In de meeste gevallen gaat het om kleine hoeveelheden. Echter, van een aantal obstetrische ingrepen en complicaties in de zwangerschap is bekend dat deze een verhoogd risico geven op een grote foetomaternale transfusie. Voorbeelden van ingrepen met een verhoogd risico zijn chorion villus biopsie (vlokkentest), amniocentese (vruchtwaterpunctie), cordocentese (navelstrengpunctie), abortus provocatus, versiepoging bij stuitligging, sectio caesarea (keizersnede) en manuele verwijdering van de placenta. Het risico is ook verhoogd bij zwangerschapscomplicaties, zoals een solutio placentae (loslating van de placenta), abdominaal trauma, een intra-uteriene vruchtdood en choriocarcinoma. Door de samenstelling van foetaal bloed worden voornamelijk foetale erythrocyten aangetroffen in maternaal bloed. Het rhesussysteem is één van de vele bloedgroepantigenen die voorkomen op erythocyten. Wanneer de foetus rhesus D positief is, kan immunisatie van de moeder optreden, hetgeen tot complicaties kan leiden bij volgende zwangerschappen. Derhalve wordt bij rhesus D negatieve zwangeren die ingrepen ondergaan of complicaties doormaken in de zwangerschap anti-D immunoglobuline toegediend ter voorkoming van rhesusimmunisatie. Op basis van bestaande literatuurgegevens zijn in het verleden richtlijnen geformuleerd, die voor elke ingreep of complicatie voorgeschrijven welke hoeveelheid anti-D immunoglobuline gegeven moet worden. Na een ingreep in de eerste helft van de zwangerschap, wanneer het getransfundeerde foetale bloedvolume minimaal is, wordt in Nederland een standaarddosering van 375 IE anti-D immunoglobuline aanbevolen. Met het vorderen van de zwangerschap en daarmee ook het stijgen van het foetoplacentaire volume, neemt ook de kans op een foetomaternale transfusie toe. Daarom wordt bij een zwangerschapsduur van 30-32 weken een profylactische dosis van 1000 IE anti-D immunoglobuline aanbevolen. Na een ongecompliceerde vaginale partus krijgt een rhesus negatieve zwangere die bevalt van een rhesus positief kind 1000 IE anti-D immunoglobuline toegediend volgens de Nederlandse richtlijn. Deze hoeveelheid is voldoende om rhesusimmunisatie te voorkomen tot een getransfundeerd foetaal volbloedvolume van 20 ml. In geval van een verhoogd risico moet nadere diagnostiek worden verricht om het foetomaternale transfusievolume te kwantificeren vóór de toediening van de standaarddosering anti-D immunoglobuline. Wanneer sprake is van een volume groter dan 20 ml, dient een aanvullende dosis anti-D immunoglobuline te worden gegeven.
Het onderscheid tussen foetale en maternale erythrocyten wordt bemoeilijkt door het ontbreken van een éénduidige foetale marker. Een veelgebruikte methode om het getransfundeerde foetale bloedvolume te bepalen bij patiënten met risicofactoren voor een foetomaternale transfusie is de Kleihauer-Betke test. Deze test werd voor het eerst beschreven in 1957 door Kleihauer, Betke en Braun en maakt gebruik van het verschil in zuurresistentie tussen foetale en volwassen erythrocyten. Door bloeduitstrijken te behandelen met een citroenzuurfosfaatbuffer, denatureert het hemoglobine in de minder zuurresistente volwassen erythrocyten, terwijl het zuurresistente foetale hemoglobine in de foetale erythrocyten intact blijft. De foetale erythrocyten kunnen dan vervolgens onder de microscoop zichtbaar gemaakt worden na aankleuring van het foetale hemoglobine met erythrosine. De afgelopen jaren zijn veel publicaties verschenen die de betrouwbaarheid en de objectiviteit van de Kleihauer-Betke test bekritiseren. Met name bij het kwantificeren van grotere hoeveelheden foetaal bloed in de maternale circulatie werd een grote inter- en intra-observer variabiliteit beschreven. Een nieuwere techniek om het foetomaternale transfusievolume te bepalen is flowcytometrie. Foetale erythrocyten in een maternaal bloedsample kunnen met deze objectieve en snelle techniek worden aangetoond na aankleuring met fluorescerende monoclonale antilichamen gericht tegen het foetale hemoglobine. Een relatief nadeel van deze methode is de ongevoeligheid om kleinere hoeveelheden foetale erythrocyten aan te tonen. Zowel bij de Kleihauer-Betke test als bij flowcytometrie kunnen zogenaamde maternale F cellen een probleem vormen. Deze cellen bevatten een kleine hoeveelheid foetaal hemoglobine, waardoor ze moeilijk te onderscheiden zijn van de echte foetale erythrocyten.
Foetale hematopoietische cellen van lymphoide en myeloide origine komen slechts in zeer lage frequenties voor in maternaal bloed en zijn derhalve moeilijk aantoonbaar. In de afgelopen jaren is wereldwijd veel onderzoek gedaan naar het detecteren van zeldzame kernhoudende foetale cellen in maternaal bloed. Een dergelijke strategie zou in de toekomst non-invasieve prenatale diagnostiek mogelijk kunnen maken. Het grote voordeel ten opzichte van invasieve methoden, zoals de chorion villus biopsie en de amniocentese, is het afwezige risico op een miskraam. Foetale kerhoudende cellen die hiervoor in aanmerking komen zijn trofoblastcellen en erythroblasten, omdat deze celtypen niet kunnen persisteren na een voorgaande zwangerschap. Klinische implementatie is echter nog niet binnen bereik wegens problemen met betrekking tot de sensitiviteit en specificiteit van de non-invasieve prenatale diagnostiek. Recent werd door Lo et al. circulerend foetaal DNA in maternaal serum aangetoond met behulp van een polymerase chain reaction (PCR). Op dit moment is het mogelijk om betrouwbaar de foetale rhesusfactor en het foetale geslacht (van belang bij geslachtsgebonden aandoeningen) antenataal te bepalen in het maternale serum.
Door het onderzoek naar foetale cellen in de maternale circulatie voor non-invasieve prenatale diagnostiek ontstonden nieuwe inzichten in de gevolgen van foetomaternaal celverkeer. Het aantonen van foetale hematopoietische voorlopercellen in maternaal bloed tot 27 jaar postpartum door Bianchi et al., heeft geleid tot vele publicaties met betrekking tot microchimerisme van foetale origine. Tot op heden is echter nog onbekend welke gevolgen microchimerisme kan hebben voor vrouwen op langere termijn.
In hoofdstuk 2 wordt een nieuwe techniek beschreven om bloeduitstrijken die werden gekleurd volgens de Kleihauer-Betke methode te beoordelen. Volgens op voorhand vastgestelde criteria werd een microscopische analyse verricht met behulp van een computer-gestuurde microscoop. De foetale erythrocyten werden onderscheiden van de maternale erythrocyten op grond van de intensiteit van de roze kleuring en de celgrootte. De automatisch gedetecteerde cellen werden opgeslagen in een database en konden vervolgens nog worden beoordeeld door een onderzoeker. Geautomatiseerde microscopie biedt voordelen ten opzichte van een handmatige beoordeling omdat een groter oppervlak van het objectglas in korte tijd kan worden geanalyseerd aan de hand van objectieve criteria. De resultaten van de geautomatiseerde en handmatige Kleihauer-Betke test werden met elkaar vergeleken in kunstmatige verdunningen die varieerden van 0.0001 tot 1% foetale erythrocyten in maternaal bloed. De twee methoden correleerden goed met elkaar. Herhaalde analyse van dezelfde verdunningen toonde aan, dat met een geautomatiseerde microscopische analyse een hoge reproduceerbaarheid kan worden bereikt met een kleine inter- en intra-observer variabiliteit. Met behulp van geautomatiseerde microscopie bleek het zelfs mogelijk om een 1 foetale erythrocyt per 1.000.000 maternale erythrocyten te detecteren.
Om de toepasbaarheid van geautomatiseerde microscopische analyse van Kleihauer-Betke gekleurde preparaten te toetsen, werden in hoofdstuk 3 bloedsamples van zwangeren beoordeeld. De resultaten van de handmatige en automatische Kleihauer-Betke test werden vergeleken met een flowcytometrische analyse van dezelfde samples, die werden aangekleurd met monoclonale antilichamen tegen foetaal hemoglobine. De patiëntenpopulatie bestond uit zwangeren opgenomen op de afdeling verloskunde, bij wie op grond van risicofactoren een indicatie bestond om een Kleihauer-Betke test te verrichten. De indicaties waren sectio caesarea, manuele placentaverwijdering, vaginaal bloedverlies, abdominaal trauma, intra-uteriene vruchtdood, solutio placentae en onverklaarde foetale en neonatale anemie. De zwangerschapsduur varieerde van 25 tot 42 weken. Bij 13 patiënten werd met geen enkele techniek een foetomaternale transfusie aangetoond. Een zeer geringe foetomaternale transfusie tot 0.1% werd alleen gedetecteerd met de handmatige en/of de geautomatiseerde Kleihauer-Betke test. De zeer geringe foetomaternale transfusie bij deze patiënten, die wel microscopisch kon worden aangetoond, werd niet gevonden met flowcytometrie. Bij 4 patiënten met obstetrische complicaties werd een foetomaternale transfusie van meer dan 0.1% gevonden met behulp van alle drie technieken. Het ging hierbij om patiënten met een gecompliceerde vaginale partus, een sectio caesarea, solutio placentae, en een choriocarcinoma. Uit een statistische analyse kwam naar voren dat er een redelijk goede overeenstemming was tussen de handmatige en geautomatiseerde Kleihauer-Betke test. Een vergelijking tussen de handmatige Kleihauer-Betke test en de flowcytometrie liet een matige overeenstemming zien. Door implementatie van een zeer gevoelige methode om foetale erythrocyten in maternaal bloed te detecteren, zoals bijvoorbeeld de geautomatiseerde Kleihauer-Betke test, zou de anti-D immunoglobuline dosering kunnen worden aangepast, rekening houdend met een bepaalde veiligheidsmarge.
Het foetoplacentaire volume in het eerste trimester van de zwangerschap is zeer gering. Door het ontbreken van een gevoelige test om zeer kleine aantallen foetale erythrocyten te detecteren, wordt derhalve in de literatuur een stijging van het alpha-foetoproteine gerelateerd aan het optreden van een foetomaternale transfusie. Het alpha-foetoproteine komt in zeer hogere concentraties voor in het foetale plasma, maar is nauwelijks aantoonbaar in gezonde volwassenen. Wanneer een foetomaternale transfusie optreedt, dan zal door een influx van het foetale plasma de maternale plasmaconcentratie van alpha-foetoproteine aanzienlijk stijgen. In voorgaande studies werd bij diagnostische ingrepen zoals een chorion villus biopsie of een amniocentese een stijging van het alpha-foetoproteine aangetoond na de ingreep.
In hoofdstuk 4 werd bij zwangeren die merendeels op leeftijdsindicatie een chorion villus biopsie ondergingen, de alpha-foetoproteineconcentratie en het aantal foetale erythrocyten voor en na de ingreep gemeten. De geautomatiseerde Kleihauer-Betke test werd gebruikt om het aantal foetale erythrocyten in maternaal bloed te kwantificeren. Hoewel een significante stijging van de alpha-foetoproteineconcentratie optrad, werd verrassend genoeg geen stijging van het aantal foetale erythrocyten gevonden. Uit eerder onderzoek is gebleken dat trofoblastcellen vroeg in de zwangerschap alpha-foetoproteine synthetiseren en dat de concentratie van dit eiwit intracellulair hoog is. Als gevolg van trofoblastdestructie tijdens de chorion villus biopsie komt het intracellulaire alpha-foetoproteine vrij en kan in de maternale circulatie terechtkomen. Een concentratiestijging van alpha-foetoproteine in maternaal bloed is dan geen goede maat voor het foetomaternale transfusievolume. Een andere verklaring is dat op de plaats van biopsie een stolsel ontstaat waardoor de foetale erythrocyten worden weggevangen en niet in de maternale circulatie terecht kunnen komen. Bij één patiënt werd echter een geringe stijging van het aantal foetale erythrocyten gevonden. Derhalve blijft het aanbevolen om na een chorion villus biopsie anti-D immunoglobuline toe te dienen aan rhesus negatieve zwangeren.
In de loop van de zwangerschap wordt de placentabarrière dunner en neemt daarmee de kans op foetomaternaal celverkeer toe. Ingrepen in het laatste trimester van de zwangerschap en tijdens de bevalling zouden het risico op een foetomaternale transfusie verhogen. Om te onderzoeken of een sectio caesarea een foetomaternale transfusie induceert, werd bij 57 patiënten voor en na de ingreep maternaal bloed afgenomen. De resultaten van deze studie worden beschreven in hoofdstuk 5. Er werd een geringe foetomaternale transfusie gedetecteerd na een sectio caesarea, zonder dat hiervoor risicofactoren werden gevonden. De concentratie alpha-foetoproteine in maternaal bloed daalde, hetgeen kan worden verklaard door het feit dat bij alle patiënten die een sectio caesarea ondergingen spinaal analgesie werd toegepast. Bij deze vorm van analgesie is het gebruikelijk intraveneus vocht toe te dienen, waardoor verdunning van het maternale bloed optreedt.
In tegenstelling tot foetale erythrocyten, is het technisch gezien veel moeilijker om foetale lymfocyten in maternaal bloed aan te tonen vanwege hun zeer lage frequentie. In hoofdstuk 6 werd bij een zwangere met een grote foetomaternale transfusie van 284 ml onderzocht in welke verhouding en hoe lang foetale erythrocyten en lymfocyten aantoonbaar zijn in maternaal bloed. In dit geval was sprake van het optreden van een spontane foetomaternale transfusie bij een zwangerschapsduur van 36 weken. Vanwege foetale nood op basis van anemie werd een spoedsectio verricht. Tot twee jaar postpartum werden maternale bloedsamples afgenomen en onderzocht op de aanwezigheid van foetale cellen. Voor het kwantificeren van foetale erythrocyten werd gebruik gemaakt van de Kleihauer-Betke test. Voor het detecteren van foetale lymphocyten werden specifieke humane antilichamen gebruikt, gericht tegen het HLA-A2 dat wel aanwezig was op de foetale maar niet op de maternale cellen. Uit de analyse bleek dat de ABO en rhesus D compatibele, foetale erythrocyten een relatief korte overlevingsduur van ongeveer 80 dagen hebben in maternaal bloed. In tegenstelling tot het aantal foetale erythrocyten direct postpartum aangetroffen in het maternale bloed, werd slechts een zeer gering aantal foetale lymfocyten gevonden. Dit aantal nam nog verder af in de tijd. De resulaten van deze studie tonen aan dat foetale lymfocyten in maternaal bloed kunnen worden gedetecteerd door gebruik te maken van HLA specifieke antilichamen en dat deze cellen zeer waarschijnlijk slechts in hele kleine aantallen circuleren. Dit zeer lage aantal van getransfundeerde foetale lymfocyten was echter voldoende om een maternale immuunrespons op te wekken.
Een recent gepubliceerde studie met betrekking tot de incidentie van een grote foetomaternale transfusie bij patiënten na een sectio caesarea of een vaginale partus, was de aanleiding voor het schrijven van hoofdstuk 7. In dit hoofdstuk wordt aan de hand van een “letter to the editor” gewezen op een fout in de door de auteurs van deze studie gehanteerde oorspronkelijke formule voor het omrekenen van het percentage foetale erythrocyten in maternaal bloed naar het getransfundeerde volume foetaal volbloed. In deze “letter to the editor” wordt uiteengezet dat de fout in de gerefereerde studie heeft geleid tot een te hoge incidentie van een grote foetomaternale transfusie zowel na een sectio caesarea als na een vaginale partus.
De studies beschreven in dit proefschrift naar methoden om foetale erythroide en lymphoide cellen in maternaal bloed aan te tonen, kunnen bijdragen tot de kennis van foetomaternaal celverkeer gedurende de zwangerschap en specifiek met betrekking tot een aantal complicaties en interventies.